falcon培养皿_falcon 培养皿

falcon培养皿_falcon 培养皿

       大家好，今天我想和大家分析一下“falcon培养皿”的优缺点。为了让大家更好地理解这个问题，我将相关资料进行了整合，现在就让我们一起来分析吧。

1.上皮细胞培养应该注意什么

2.的步骤有哪些，最关键是哪一步

3.化学实验中的重悬是什么意思

4.DNA主要反映遗传物质的化学组成 怎么理解?

5.胚胎干细胞培养是如何培养的？它的具体操作过程？饲养层细胞是成纤维细胞，那它的详细作用是什麽？

6.请教：小鼠血管内皮细胞的培养方法

上皮细胞培养应该注意什么

       上皮细胞培养1)表皮细胞培养1.取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.5～1 平方厘米小块。2.EDTA 处理：先置入0.02%EDTA 中室温置5 分钟。3.冷消化：换入0.25%胰蛋白酶中，置4℃过夜。4.分离：取出皮肤，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开。5.温消化：取出表皮单独处理，用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25%胰蛋白酶中，37℃再消化30～60 分钟。6.用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液。7.培养液：通过80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle液和20%小牛血清，制成细胞悬液，接种入碟皿中，CO2 温箱培养。2) 乳腺组织培养直接培养法：(适于培养含纤维少的软组织)1.在含有少量培养液或Hanks 液的容器中，用锋利刀片将组织反复切割成碎块。2.把组织碎块连同液体注入离心管中，再补加少许培养液，用吸管吹打片刻，置试管架3～5 分钟。吸除上层液可排除非乳腺细胞部分。重复2～3 次。3.末次处理结束后，向沉降管中再补加培养液，用吸管稍吹打，使沉降物重悬。不待细胞团块下降立即通过3～4 层无菌纱布滤入另管中。4.调整好适宜密度，接种入培养瓶中培养。胶原酶消化法：(适于处理含纤维多的较硬组织)其过程与培养其它组织相同。3) 胃上皮细胞培养1.取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许。2.清洗：用含庆大霉素(400 微克/毫升)和二性霉素(2 微克/毫升的Hanks)液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成1mm3 大小。3.消化：在I 型胶原酶和透明质酸酶中，于37℃中消化80 分钟。4.离心：收集细胞悬液，800 转/分离心后，Hanks 液漂洗两次。5.接种：末次离心后加入含有1%～2%胎牛血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养板中，接种量依不同实验目的而定。4) 肝细胞培养初代组织块培养：取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝脏剪成1mm3 左右的小块，采用帖壁培养法。初代消化法培养：1.把肝组织切成2～4 立方毫米的小块，用不含钙镁的BSS 液洗两次。2.移入1：1 的0.1%胰蛋白酶和0.1%胶原酶(都用无钙镁BSS 配置)中，4℃冷消化10～12 小时后，通过250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过。3.收集细胞、BSS 液洗1～2 次、计数、接种培养。消化培养肝细胞的另一种方法是灌流法(肝脏灌流需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好)：1.无菌解剖动物，取出肝脏，先用BSS 洗除血污。2.取5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器头轻轻插入肝管中，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注入肝管系统，并不时轻揉压肝脏，以便消化液进入肝小叶中;消化液在肝内停留20～30 分后，在吸出消化液的同时并轻揉压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出。3.待吸净消化液后，注入离心管中，低速离心分离，用RPMI 1640 培养基培养(较其它培养基为好)，能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。传代培养：待细胞生长连接成片后，用BSS 洗一二次，加1：1 的0.025%胰蛋白酶和0.02% EDTA 混合消化3～5 分钟，待细胞回缩，便停止消化，弃掉消化液，用BSS洗一二次，注入营养液，吹打，制成细胞悬液，再接种培养。5)内皮细胞培养1.取产后的新鲜脐带。如不立即培养可以保存于4℃中，但不宜超过12 小时。无菌剪取长10～15 厘米一段。其它如胚胎和幼体动物的大血管，亦可用于培养。2.先用三通注射器吸温PBS 液注入脐带的静脉中，洗除残血，注入口处宜用线绳结扎，以防液体返流。3.用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1%的胶原酶，待末端出现液体后结扎之，令充满血管，注入口亦应结扎，以防液体返流，消化3～10 分钟。4.吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心管中，为获取更多细胞，可再注入温PBS 冲洗2～3 次彻底清除干净残余细胞，一并注入离心管中离心。5.吸除上清，加1640 培养液，制成细胞悬液，接种入瓶皿中培养，顺利时2～3 天内细胞即可长成单层。6)毛细血管内皮细胞培养肿瘤条件培养基制备：1.取C3H 小鼠的S-180 实体肉瘤组织。2.胰蛋白酶消化，Dulbecco 改良Eagle 氏培养液15ml(含10%小牛血清)，接种到T-75 Falcon 产培养瓶中培养。3.在细胞生长接近完全汇合时，收集培养液制成条件培养基;再用含10%小牛血清的新培养液后，也每隔两天收集一次，可获得多量条件培养基。4.4000 转/分离心后，再通过0.22μm 微孔滤膜滤过，-20℃冻存备用(临用前融解)。初代培养：1.取材：取新鲜牛肾上腺数个，先用Hanks 液洗除血污。2.剥除被膜，分离出皮质，切成1 立方毫米小块，加0.5%胶原酶室温中消化1 小时，每隔10 分钟用吸管吹打悬液令消化充分。3.通过不锈钢纱网滤过，网眼要求只允许能通过小于110 微米长的毛细血管小段。4.650rpm，4℃，离心7 分钟后，弃掉上清胶原酶。5.沉淀物用培养液重悬并离心，再重悬，再离心，共两次。6.末次沉淀物仍用含有10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle 氏培养液重悬后，稍吹打。7.接种于铺有明胶底层的培养皿中，37℃培养，在培养头1～3 小时中，毛细血管小段和内皮细胞最先帖附于底物上，而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮。8.趁此时，吸除培养液，再加入肿瘤条件培养液，每两天换液一次。毛细血管小段一般成自1～4 个内皮细胞，以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛，能持续2～5 天。毛细血管内皮细胞分离培养：1.初代培养2～3 天后，镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛，在培养皿背面，用不脱色笔划圈圈起。2.镜下检查，如圈内残有非内皮细胞时，可用显微细针在倒置显微镜下挑除。此操作用细胞解剖器或用手操作均可，宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行，但时间不宜过长(15～20 分钟)，圈内非内皮细胞可用无菌胶刮除。3.用培养液漂洗两次，以去除漂浮细胞。4.剩余内皮细胞岛如小(5～20 个细胞)而少时，生长增值变得缓慢或不完全不生长，此时需加入3T3 等饲细胞，饲细胞接种量为4000 细胞/cm2。5.当内皮细胞充满所有饲细胞空间后，用胰蛋白酶消化、离心、加入肿瘤条件培养基。6.接种入明胶底物皿中继续培养(饲细胞死亡淘汰)，细胞增殖生长汇合后，按1：5 传代。 楼主以后想要查找这方面的信息，可以到生物帮那里，我那里的信息挺全面的，信息内容丰富、科学、专业。有空个可以去 www.bio1000.com/zt/cell/201378.html 那里看下，会有帮助的。

的步骤有哪些，最关键是哪一步

       肝星状细胞会对huh7细胞的形态产生影响

       肝星状细胞的培养，原代分离方法,仅供参考.

       1.1动物准备 雄性SD大鼠，体重500g左右，常规饲料喂养，正常饮水。在分离HSCs前2周每天VitaminA

       200IU/100g体重胃管内注入。

       1.2. 主要试剂与仪器

       1.2.1试剂：Collagenase

       IV、PronaseE、鼠型VEGF、DNaseI，RPMI1640培养基、胎牛血清、马血清、Percoll。

       1.3肝星状细胞的分离与纯化

       分离当日氯胺酮0.2ml/100g体重、肝素150IU肌肉注射麻醉后，严格消毒。置于无菌超净台，仰卧位固定。开腹后门静脉插管灌注。具体操作如下：取大十字切口，上至剑突，下至耻骨联合，左右至两侧腋中线。皮瓣外翻，显露腹腔所有脏器。将小肠翻至鼠体左侧，可见肝门处门静脉由脾静脉和肠系膜静脉汇合而成。在双肾静脉上方游离肝下下腔静脉。肝上游离肝膈面，下压肝脏剪断镰状韧带至肝上下腔静脉。将9号输液针插入门静脉，动脉夹固定，转动灌流泵。同时迅速钳夹肝上下腔静脉，剪开事先游离好的肾静脉上肝下下腔静脉，整个原位灌流过程开始。

       首先使用加葡萄糖1.0g/L、肝素5000IU/L的D-Hank’s液200ml，水浴加热至39℃，流速为20ml/min。尽量将肝脏内淤积的红细胞冲出。然后使用酶灌注液，0.05mmol／LCa2＋、0.05%CollagenaseIV、0.08％PronaseE、4.8g／L

       HEPES（pH7.4－7.6）、5％FCS-HI的D-Hank’s液100ml，流速为5ml／min，消化肝脏。20分钟后使用无菌剪刀将肝组织剪下放入洁净的培养皿中，进入细胞室进行以下操作。在培养皿中去除肝包膜和Glisson鞘。将肝脏粉碎成糊状，放入0.05％CollagenaseIV、0.001％DNaseI和5.3%FCS-HI(V/V)的PBS中，37℃水浴摇动30分钟，使肝组织充分得到消化。将消化好的肝组织过100目钢丝筛，未能通过的肝组织用玻璃注射器针芯研磨，RPMI1640培养液冲洗。滤过的肝组织放入50mlFalcon离心管中，加RPMI1640培养液至50ml，20℃100x

       g离心5分钟，去除大部分肝实质细胞。上清转入另一Falcon管中350x g离心10分钟。取沉淀重悬于50mlRPMI1640培养液中，再次350x

       g离心10分钟。沉淀重悬于16ml的PBS中，分两份分别加入已经铺好梯度的Percoll的顶层。Percoll的密度梯度分为3层：由上至下依次为20％（密度~1.012

       g/ml）20ml、35％（密度~1.014 g/ml）15ml、50％（密度~1.018g/ml）10ml。铺好后4℃900x

       g离心30分钟。轻轻取出，不要摇动液面，可见在20％Percoll层中间有一混浊带。用16号针头插入液面下此处抽吸约10ml。加RPMI1640培养液至50ml，900x

       g离心10分钟，沉淀重悬于10ml左右RPMI1640＋199混合培养液中，内加入10％胎牛血清和10％马血清以及10ng／ml的VEGF等。计数细胞产量并且行台盼蓝拒染试验，判断活力。

       1.4

       细胞培养

       重悬细胞计数后按1.5x106／孔接种于铺被胶原S的24孔板。10分钟后重吸细胞混悬液入新孔。3天后首次换液，以后视情况每2－3天换液一次。如需作免疫组化等分析，可将细胞接种于内有玻片的6孔板中。细胞融合达到80％－90％左右可进行传代。传代时常规使用0.125％胰酶。

       1.5细胞鉴定

       细胞纯度鉴定在3天后细胞显现梭形形态时，使用高倍镜每孔随机选择10个视野，每个视野至少计数200个细胞。325nm波长紫外光激发细胞自发荧光。光镜、透射电子显微镜观察细胞形态。免疫组织化学方法鉴定原代HSCs和传代HSCs

       Desmin、α-SMA的表达情况。

化学实验中的重悬是什么意思

       的过程:　

       又该称体外受精胚胎移植，具体地说是借助内窥镜或在B超指引下，从患有不孕症妇女的卵巢内取出成熟的卵子，将精子、卵子一起放入培养皿，体外培养三天左右，使卵子受精，然后再在B超监视下将其送到母亲子宫，使之逐步发育成胎儿的过程。也就是说经过取卵受精植入三部曲，最后还是要在母亲子宫内发育成熟直至分娩。

       传统的取卵方式是给患者打，由于个体差异和盆腔解剖位置的不同，患者疼痛感受差异和以往对药物的反应等不同对手术疼痛感觉差异相对较大，极易出现药劲没上来取卵手术已经开始，或者药劲过去了取卵手术还未完成的，这会给患者带来很大的伤害，254医院辅助生殖中心采用国际标准操作，在津独家开展了B超引导下微创无痛取卵，至今已完成千余例手术，均获得较满意的临床效果。

现状：　

       经过多年发展，技术已经相当成熟，第一代技术解决女方输卵管不通;第二代技术解决男性少、弱精子;第三代技术，是辅助生殖技术与现代分子诊断相结合的产物。解决父母一方或双方有染色体疾病，没有办法正常生育的患者通过这项技术在胚胎移植前筛选一些没有遗传性疾病的移植到子宫里面去，让患者受孕。

DNA主要反映遗传物质的化学组成 怎么理解?

       重悬就是“重新悬浮”，具体操作是用适当的缓冲液或培养液将离心或沉降等方法得到的固体（沉淀、细胞、活性物质等等）重新悬浮。　

       例如胚胎干细胞培养中的细胞复苏一项，步骤为：　

       1．从液氮中取出一管细胞；　

       2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；　

       3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；　

       4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；　

       5．离心3分钟；　

       6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；　

       7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；　

       8．孵育。

胚胎干细胞培养是如何培养的？它的具体操作过程？饲养层细胞是成纤维细胞，那它的详细作用是什麽？

       分子生物学实验基础知识2006-11-17 16:31分子生物学实验基础知识

       分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（transformation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。

       外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。

       一、基因工程的常用工具

       （一）载体

       载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。

       质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Apr、抗四环素Tcr等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。

       常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。

       （二）工具酶

       工具酶是基因重组技术不可缺少的工具。主要有限制性内切酶、连接酶、核酸聚合酶、逆转录酶、核酸酶等。

       限制性内切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA内切酶之分，Ⅱ型能严格识别核酸序列，并在识别区内特定的核苷酸处切开DNA双链。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA内切酶。识别分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋转对称。切口分开端和粘端，产生3′－OH和5′－P末端。内切酶品种多，使用时应注意温度、缓冲液用量（一般1μg DNA/2-5单位酶）等反应条件。

       酶 识别序列 切口

       Alu Ⅰ …AGCT… …AG CT… 四核苷酸

       …TCGA… …TC GA… 平端切口

       Eco R1 …GAATTC… …G AATTC… 六核苷酸

       …CTTAAG… …CTTAA G… 粘端切口

       连接酶有T4噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶、大肠埃希菌DNA连接酶等。DNA连接酶可连接平端，也连接粘端。反应需有Mg2+和ATP存在，pH7.5-7.6。最适温度37℃，30℃以下活性明显下降，但考虑到被连接DNa 的稳定性和粘性末端的退火温度，一般平端连接用20-25℃，粘端连接用12℃左右。

       聚合酶有DNA聚合酶（以DNA为模板合成DNA大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌体DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA为模板合成RNA，T7或T3噬菌体RNA聚合酶）；逆转录酶（以RNA为模板合成DNA，除RNA病毒中发现外，发现大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆转录活性）。

       大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草杆菌酶作用产生的一个大片段，有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性，无3′→5′外切酶活性。可用于缺口翻译（Nick translation）法标记核酸，也可用于DNA序列测定，修补DNA链等。

       核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相应的DNA和RNA，核酸酶S1可降解单链DNA和RNA，用量增大也可降解双链核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环。

       末端转移酶在Mg2+存在下，选择3′－OH端单链DNA为引物加成核苷酸，在Co2+存在下，选择3′－OH端双链DNA为引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端标记和核酸连接的互补多聚尾（连接器）。

       碱性磷酸酶去除5′－P，可防止二分子DNA片段5′端P基团自身空间障碍，影响DNA分子之间的连接，一般用碱性磷酸酶处理载体DNA除去5′端P基团，在连接酶作用下目的基因的5′端P先与载体3′端OH连接，再通过复制修复另一条链，使二条链完全连接。该方法大大提高了连接效率（图18-1）。

       图18-1 经碱性磷酸酶处理后载体DNA与目的基因DNA的连接

       二、目 的 基 因

       常把需研究的基因称为目的基因，需分析的基因称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因，有时三者含义相近。简单的原核生物目的基因可从细胞核中直接分离得到，但人类的基因分布在23对染色体上，较难从直接法得到。简短的目的基因可在了解一级结构或通过了解多肽链一级结构氨基酸编码的核苷酸序列基础上人工合成。但多数的目的基因由mRNA合成cDNA（complementary DNA，反转录DNA）得到。CDNA通过各种方式与载体连接，克隆可得到全长cDNA或片段，用于探针制备、序列分析、基因表达等研究。因此以cDNA为研究材料反映了mRNA的转录及对以后翻译的影响情况，即反映某一基因（DNA）外显子的情况。（图18-2）

       图18-2 目的基因cDNA的合成

       三、基因库的建立

       建立基因库的目的是为了便于目的基因的保存、扩增和纯化。基因库是利用工具酶，通过基因重组技术和转化、筛选而建立，也是基因克隆的过程。实际上是利用低等生物如细菌、病毒、噬菌体等生长快，繁殖力强的特点，而作为一种核酸扩增筛选的载体，把人类等高等生物的基因或其片段用工具酶插入，重组于其中，经筛选，克隆得到目的基因与载体重组的重组基因，成为便于保存，取用方便的基因库。基因库交流是研究室之间交流目的基因的常用方式。

       （一）基因重组

       基因重组方案很多，简单的可用同一种限制性内切酶分别在载体和目的基因切出相对应的切口，便于连接。也可用末端连接酶合成连接器（图18-3）。近年，Okayama方案为实验室普遍采用，该方法可得到全长的cDNA。

       （二）转化

       转化目的是把有复制能力，但在细胞外无复制活性的目的基因-载体重组体装入细胞（大肠埃希菌），使目的基因随载体在细胞内复制、扩增。实验步骤介绍如下：

       图18-3 基因重组方案之一

       ⒈大肠埃希菌的处理（增加细胞膜通透性，便于基因进入细胞）大肠埃希菌（E.Coli cells）接种于Lb agar培养基，37℃培养一晚。挑选3~5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37℃，振摇培养一晚后，在A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为细菌对数生长期），野生型（rec＋，5x107cells/ml）为0.2-0.3，缺陷型（rec-，5x107cells/ml）为0.5-0.6。离心弃去上清液，用20ml，50mmol/L，CaCl2悬浮菌体。冰浴20分钟，低温离心。弃上清液，用2.5ml冰50mmol/l CaCl2悬浮。4℃可保存48小时，用于转化，称competent cells。

       ⒉质粒（如经基因重组建立的重组质粒，基因库等）的转化 将competent cells（以美国BRL公司DH10B菌株为例）置冰水浴。同时将Falcon2059（传热系数稳定）塑料试管置冰水浴。取100μl菌液（DH10B）于2059试管中，加10倍稀释的巯基乙醇1μl，冰浴轻摇2分钟，放置10分钟。取0.1-50ng质粒加入试管，轻轻摇匀，冰浴30分钟。此间备好42℃水浴。并将SOC培养基置42℃备用。将试管置于42℃，轻摇45秒钟，马上置冰浴2分钟。使competent cells热胀冷缩，把质粒导入菌体。加42℃SOC培养基0.9ml于试管，37℃培养1小时。1000rpm离心10分钟，弃上清液，用200μlSOC培养基悬浮菌体。接种于LB-氨芐青霉素（100U/ml）培养皿，37℃培养一晚。已转化的菌体可形成菌落（因质粒上有抗氨芐青霉素基因）。在了解目的基因或其产物的基础上对菌落进行鉴定。并在LB培养液中扩大培养。基因库的建立、转化、筛选、扩增、纯化的过程就是基因克隆的过程。

       LB培养基（1L）：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g NaCl，高压灭菌，pH7.5。

       SOB培养基（1L）：20g蛋白胨，5g酵母膏，0.5g NaCl，高压灭菌。另外准备2mol/L镁溶液（1mol/L氯化镁与1mol/L硫酸镁等量混匀，过滤灭菌），临用前加1ml于100ml培养基。

       SOC培养基（100ml）：临用前加入1ml过滤灭菌的2mol/L葡萄糖。

       四、核酸的分离与纯化

       核酸存在于多种细胞，如病毒、细菌、寄生虫、动植物细胞；多种标本中，如血液、组织、唾液、尿液等其它来源的标本。因此分离方法复杂而多样。又因各种DNA、RNA的丰度差异，各种分析方法对核酸的纯度与量的要求有差异，因此在实验前应对采用的方法有所了解和选择。总的说来核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上，利用苯酚等有机溶剂抽提（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯化；乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，收获。溶解细胞的方法因标本不同而不同，有用SDS加NaOH，有用蛋白酶，有的用超声波破碎等方法，苯酚提取主要使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目的。实验上生物标本中含量最多的就是蛋白质。为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸，通过离心回收核酸，然后用70％-80％乙醇洗涤沉淀，除去多余的盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。为了得到纯的核酸可用蛋白酶除去蛋白，用RNA酶除去RNA，得到纯的DNA，用DNA酶除去DNA而获得RNA。目前开发了许多商品化的核酸分离柱，可简单、快速地分离得到纯度很高的DNA或RNA。其分离原理有的利用核酸的分子量差异，有的利用需分离核酸的特点与其特异性结合达到分离、回收的目的。

       （一）质粒的分离与纯化

       含质粒的E. Coli cells经LB培养液250ml扩大培养，倒入50ml离心管，4℃，3000rpm，离心15分钟。弃去上清液。（弃去液丢弃前应作消毒处理，以免污染环境）。加lysis buffer(50mmol/L Glucose，10mmol/l EDTA，25mmol/l Tris-HCl，pH8.0)1-2ml使之悬浮。放置室温5分钟，加3.5-7ml新配制SDS/NaOH溶液（1mol/l NaOH 8ml，20％SDs 2ml，蒸馏水30ml）上下摇匀，置冰水浴5分钟。禁用混匀器，以免DNA分子断裂），加2.5mol/L醋酸钾缓冲液（pH4.8）2.6-5.2ml，上下摇匀，冰浴5分钟。4℃，3000rpm，离心15分钟。沉淀蛋白质。取上清液，加无水乙醇12-24ml（上清液的二倍）放室温15分钟后，10000rpm离心，弃上清液。加约为沉淀物体积的0.4倍TE（10mmol/l Tris-Hcl pH8.0，10mmol/l EDTA）溶解沉淀后，加0.2倍的7.5mol/L醋酸铵。可用混匀器混匀，置冰浴10分钟。4℃，10000rpm离心5min，弃上清液。加沉淀物0.4倍的10mmol/l Tris-HCl pH7.5，10mmol/l EDTA缓冲液，1/10体积的5mg/ml RNase，37℃，30分钟保温。加等量的phenol（酚）/CIAA(480ml氯仿，20ml异戊醇)，混匀。4℃，10000rpm，离心5分钟。取上层液加酚/CIAA重复一次。取上层液加1/10体积5mol/l NaCl和2倍无水乙醇，―20℃过夜或―70℃2小时以上。4℃，10000rpm，离心10分钟，弃上清液。加80％乙醇不摇动，直接10000rpm离心，弃上清液，真空干燥。加适量（约200μl）TE溶解。测定含量后备用。

       （二）重组质粒中目的基因的分离与纯化

       先取少量纯化的重组质粒，用限制性内切酶切出目的基因，经电泳分离，确认。以200μl含2mg DNA（重组质粒）为例：取10μl含100μg DNA，加90μl TE。按1μg DNA加2-5U限制性内切酶，1/10体积缓冲液，1-2小时保温。缓冲液种类和酶反应温度因内切酶种类而异。1/10体积3mol/l NaAc，2倍无水乙醇，－70℃，2小时（－20℃过夜），10000rpm，10分钟离心，弃上清液（乙醇沉淀）。适量TE溶解沉淀（切断的DNA质粒与目的基因混合物），电泳分离（用相应分子量DNA标准同时电泳），在紫外光下观察结果，与标准DNA分子量比较，确认目的基因和内切酶的切割效果。

       ⒈电泳条件：

       凝胶制备： 1％琼脂糖凝胶 agarose(mg) X50TAE(ml) EB(溴化乙锭μl)

       (agarose) 1000 2.0 4.0

       总体积（ml）

       100

       胶浓度（％）： 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

       DNA长度（kb）： 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1

       电泳缓冲液： X50TAE(ml) EB(μl) 总体积(ml)

       20 30 1000

       X50TAE：Trisma base 54g；乙酸57.1ml；0.5m EDTA pH8.0 20ml；蒸馏水至1000ml。

       EB：10mg/ml ethidium bromide。(EB有致癌性，操作应小心)。

       经电泳确认后，取适量DNA（重组质粒）同上条件切开，用1.5％低熔点（＜65℃熔解）琼脂糖凝胶，电泳分离。在紫外光下，切出含目的基因区带（凝胶），放入离心管中，提取纯化。

       ⒉从低熔点凝胶提取，纯化DNA片段 加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚（TE饱和，TE封在上层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀），12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可用于目的基因结构分析，探针制备等）。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收DNA片段。

       （三）标本DNA的分离与纯化

       用5-10ml 1xNTE(NaCl 100mmol/L ,Tris-HCl 10mmol/l pH7.4，EDTa 1mmol/L pH8.0)调整细胞为2×107个（组织应切碎置液氮冰冻，高速搅切成粉末后，加入缓冲液）。加1/10-1/20体积（V）10mg/ml蛋白酶（Sigma Ⅷ型），1/20v 10％SDS，37℃2小时。加等量酚/3xNTE(3xNTE上封)混匀（至少7分钟）。4℃，3000rpm，10分钟。取上清液，加2ml TE(Tris-HCl 10mmol/L pH7.5，EDTa 1mmol/L pH8.0)，充分混匀。乙醇沉淀。2mlTE溶解沉淀。加1/30xNTE，蛋白酶K(10mg/ml)代替蛋白酶重复2-4步骤。测定含量。

       （四）样品RNA的分离，纯化

       含106个细胞液加等量纯化溶液[4mol/L胍基硫氰酸盐，25mmol/L柠檬酸pH7.0，0.5％肌氨酸（sarcosyl），0.1mol/l 2-巯基乙醇]。总体积为细胞沉淀4-5倍，混匀。加0.1体积2ml/L乙酸钠（pH4.1），1体积酚（重蒸水上封），0.2体积CIAA，混匀器剧烈混合10秒钟。冰水浴15分钟。10000xg4℃，20分钟。离心（不用刹车）。小心取出上清液。加等量丙酮（或2倍乙醇），－20℃，60分钟以上。10000xg，4℃，20分钟离心。弃上清液。用1.5ml离心管约加0.3ml纯化溶液，重复3)步骤，离心10分钟，弃上清液。加75％乙醇，10000xg，4℃，10分钟离心。弃上清液。真空干燥15分钟，备用。

       五、探针制备

       探针制备就是目的基因的标记，核酸标记方法常用的有缺口平移法、随机引物法、末端标记法等。标记物质有放射性元素（如32P等）和非放射性物质（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸标记同位素，被标记的dNTP本身就带有磷酸基团，便于标记，特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β射线能量高，可达1.70MeV，用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。32P的半寿期为14天，应随标随用，一般标记后，在一周内使用，它虽带来不便，但给使用后废弃物处理减轻了压力。使用32P标记物应注意防护，操作时应有1-1.5cm厚聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃隔离保护，避免直接照射。操作人员胸前应佩带个人计量器，定期检测。结束实验后，应用专用探测器（盖革-米勒检测器），检查工作区域、手、衣服等，以免污染发生。其它同位素标记物，同样应注意放射线防护。

       非放射性标记有酶标和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的抗体，事实上被标记的抗体也称为探针，阅读文献时应加以注意。现有许多商品是生物素（biotin）、地高辛标记的，如生物素-dUTP、生物素-dATP、地高辛-dUTP等。血凝素（avidin）与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶（血凝素-酶），经杂交反应最终形成：探针-生物素-血凝素-酶复合物（ABC法）。酶催化底物显色，观察结果。与一般的酶反应底物不同，ABC法底物显色后为不溶物，以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差、成本高，但便于运输保存，灵敏度与放射物标记相当。化学物标记有的也是利用相应酶标抗体形成特异复合物，与上述方法相当，有的则可自发光。化学标记法简单、成本低，但灵敏度相对较低。

       分子生物学实验基础知识

请教：小鼠血管内皮细胞的培养方法

       推荐胚胎干细胞培养标准化操作规程胚胎干细胞培养标准化操作规程 6/28/01

       目录

       一、细胞

       二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态

       培养基

       细胞复苏

       冻存细胞

       明胶包被

       细胞传代

       三、体外分化

       培养基

       包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

       体外分化方法

       四、移植细胞的准备

       细胞

       多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡

       1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。

       2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。

       3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。

       4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。

       5．表达**荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。

       一般培养--维持ES细胞处于未分化状态

       ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

       培养基

       ES:

       配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。

       贮存液

       DMEM(高糖)

       马血清（HS）

       L-谷氨酰胺（200mM）

       MEM NEAA（10mM）

       HEPES（1M）

       β-巯基乙醇（55Mm）

       PEST

       ESGRO

       复苏细胞

       细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

       步骤：

       1．从液氮中取出一管细胞；

       2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；

       3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；

       4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；

       5．离心3分钟；

       6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；

       7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；

       8．孵育。

       冻存细胞

       冻存液

       90％HS和10％二甲基亚砜

       步骤：

       1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；

       2．用细胞刮刀收集细胞；

       3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；

       4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）

       5．分装于冻存管内，每管1ml；

       6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。

       明胶包被

       准备500ml 0.1％明胶溶液

       1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。

       2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。

       包被培养板或培养皿

       1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；

       2．置室温30分钟；

       3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。

       细胞传代

       建议每2－3天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。

       1．去除培养液；

       2．1×无钙镁PBS洗涤；

       3．加入1×胰酶EDTA(10×胰酶EDTA用PBS稀释。)37℃孵育5分钟。

       4．加入ES培养基使胰酶失活；

       5．将细胞转入15ml离心管中离心3min；

       6．去除上清，将细胞重悬于2mlES培养基，至少吹打10－20次。

       如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。

       7．将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；

       8．将含有细胞的培养基转入明胶包被（见下文）的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）

       9．建议按1：4－1：10的比率传代(ATCC)

       保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。

       体外分化

       多能胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。

       时间线（总时间为27～34天）

       第2步；4＋1天 第3步；4－10天 第4步；4天 第5步；10－15天

       培养基

       EB

       配制一20×不含DMEM，FBS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。

       贮存液

       DMEM(高糖)

       胎牛血清

       L-谷氨酰胺（200mM）

       MEM NEAA（10mM）

       HEPES（1M）

       β-巯基乙醇（55Mm）

       PEST（P104U/mlS104μg/ml

       ITSFn and N3：

       配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml FALCON管中，（稀释为1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。

       贮存液

       DMEM(高糖)

       转铁蛋白50mg/ml

       胰岛素5mg/ml

       亚硒酸钠300μM

       （20μM）

       腐胺（100μM）

       PEST（P104U/ml S104μg/ml）

       层粘连蛋白100μg/ml

       纤维连接蛋白250μg/ml

       碱性rhFGF, 10μg/ml

       *在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。

       ITSFn and N3培养基贮存液的准备

       使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。

       贮存液 溶剂，贮存液，稀释剂和储存

       转铁蛋白50mg/ml

       胰岛素5mg/ml

       亚硒酸钠300μM

       （20μM）

       腐胺（100μM）

       PEST（P104U/ml S104μg/ml）

       层粘连蛋白（100μg/ml）

       纤维连接蛋白（250μg/ml ）

       碱性rhFGF, （10μg/ml）

       包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

       包被液的准备

       多聚-L-鸟氨酸，15μg/ml

       把75ml多聚-L-鸟氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。

       纤维结合蛋白，1μg/ml

       把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。

       包被过程：

       1．加入多聚-L-鸟氨酸，至少2－3小时（过夜也行）

       2．吸出多聚-L-鸟氨酸

       3．加入纤维结合蛋白，大约1－2小时

       4．吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干

       5．贮存在4℃

       24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。

       体外分化方法

       第1步：ES培养基

       在LIF（ESGRO）存在的条件下维持细胞培养

       第2步：EB培养基

       使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。

       1．分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）

       2．纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。

       3．用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液

       4．一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。

       5．2天后更换培养基

       将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。

       6．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。

       形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。

       第3步--ITSFn培养基

       在最少量培养基中选择神经前体细胞

       1．在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基

       2．并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。

       3．保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。

       观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。

       第4步－N3培养基＋bFGF

       通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。

       1.PBS洗涤，加入2ml 1×胰酶（1个15cm的培养皿所需胰酶的量根据前文表中的体积）（10×胰酶EDTA用PBS稀释）

       2．37℃孵育5分钟

       3．用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。

       4．将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。

       5．将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。

       6．2天后更换培养基

       第5步－N3培养基

       通过撤除bFGF使神经前体细胞分化

       1．细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基

       2．根据需要换液（大约每隔一天）

       3．分化10～15天后固定细胞

       移除培养基

       PBS洗涤

       加入4%福尔马林

       室温放置30分钟

       PBS洗涤2次

       储存于PBS。长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS

       移植细胞的准备

       细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。

       移植

       1．将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。

       细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。

       2．去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中

       3．离心3分钟

       4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml）

       5．37℃水浴5分钟

       6．加入5mlEB培养基小心吹打约10次

       小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。

       7．离心2分钟

       8．吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基

       9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次

       10．离心2次

       11．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基

       烟酸己可碱标记ES细胞进行移植

       1．准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118）

       2．加入1mg（你能称到的最小量）到5ml EB培养基（制成200μg/ml）

       3．将溶液稀释成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养基）

       4．如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液，

       5．将悬液置于室温（或冰上）30分钟

       6．离心2分钟

       7．吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基

       8．重复一次

       9．离心2分钟

       10．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。 这是我最近翻译的一篇有关胚胎干细胞的文章，译的不好，但是意思应该还算准确。不好意思，有两个表格没有发上，哪位老师告诉我该如何编辑表格。谢谢了！ 谢谢，顶！ 我也顶 很好的帖子哦!我查了好久终于找到了.万分感谢! 谢谢，现在还没用到，就当先了解一下好了。再次谢谢！ 谢谢非常感谢 有原文吗？

       如果有可以发到我邮箱（j3104@163.com）吗？谢谢！！ 好贴！

       能将英文原文贴上吗？或者发到我的信箱：adjfchen@hotmail.com

       谢谢！ 不错不错，我这里发一些关于干细胞的相关知识

       干细胞的概念

       干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。最新研究发现，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。

       在胚胎的发生发育中，单个受精卵可以分裂发育为多细胞的组织或器官。在成年动物中，正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生。胚胎的分化形成和成年组织的再生是干细胞进一步分化的结果。胚胎干细胞是全能的，具有分化为几乎全部组织和器官的能力。而成年组织或器官内的干细胞一般认为具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。

       然而，这个观点目前受到了挑战。

       最新的研究表明，组织特异性干细胞同样具有分化成其他细胞或组织的潜能，这为干细胞的应用开创了更广泛的空间。

       干细胞具有自我更新能力（Self-renewing），能够产生高度分化的功能细胞。干细胞按照生存阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞 。

       1.1 胚胎干细胞

       胚胎干细胞（Embryonic Stem cell， ES细胞）

       当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。早在1970年Martin Evans已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养。而人的胚胎干细胞的体外培养直到最近才获得成功。

       进一步说，胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。

       目前许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如：德美医学小组在去年成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。此后，密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。随着ES细胞的研究日益深入，生命科学家对人类ES细胞的了解迈入了一个新的阶段。在98年末，两个研究小组成功的培养出人类ES细胞，保持了ES细胞分化为各种体细胞的全能性。这样就使科学家利用人类ES细胞治疗各种疾病成为可能。然而，人类ES 细胞的研究工作引起了全世界范围内的很大争议，出于社会伦理学方面的原因，有些国家甚至明令禁止进行人类ES细胞研究。无论从基础研究角度来讲还是从临床应用方面来看，人类ES细胞带给人类的益处远远大于在伦理方面可能造成的负面影响，因此要求展开人类ES细胞研究的呼声也一浪高似一浪。

       1.2 成体干细胞

        成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。过去认为成体干细胞主要包括上皮干细胞和造血干细胞。最近研究表明，以往认为不能再生的神经组织仍然包含神经干细胞,说明成体干细胞普遍存在，问题是如何寻找和分离各种组织特异性干细胞。成体干细胞经常位于特定的微环境中。微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。

       1.3 造血干细

       造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。今年年初，协和医大血液学研究所的庞文新又在肌肉组织中发现了具有造血潜能的干细胞。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。

       上皮细胞培养1)表皮细胞培养1.取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块,以角化层薄者为佳,早产流产儿皮肤更好,切成0.5～1 平方厘米小块.2.EDTA 处理：先置入0.02%EDTA 中室温置5 分钟.3.冷消化：换入0.25%胰蛋白酶中,置4℃过夜.4.分离：取出皮肤,用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开.5.温消化：取出表皮单独处理,用剪刀剪成更小的块后,置入新的0.25%胰蛋白酶中,37℃再消化30～60 分钟.6.用吸管轻轻反复吹打,使成细胞悬液.7.培养液：通过80 目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸上清,直接加入Eagle液和20%小牛血清,制成细胞悬液,接种入碟皿中,CO2 温箱培养.2) 乳腺组织培养直接培养法：(适于培养含纤维少的软组织)1.在含有少量培养液或Hanks 液的容器中,用锋利刀片将组织反复切割成碎块.2.把组织碎块连同液体注入离心管中,再补加少许培养液,用吸管吹打片刻,置试管架3～5 分钟.吸除上层液可排除非乳腺细胞部分.重复2～3 次.3.末次处理结束后,向沉降管中再补加培养液,用吸管稍吹打,使沉降物重悬.不待细胞团块下降立即通过3～4 层无菌纱布滤入另管中.4.调整好适宜密度,接种入培养瓶中培养.胶原酶消化法：(适于处理含纤维多的较硬组织)其过程与培养其它组织相同.3) 胃上皮细胞培养1.取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许.2.清洗：用含庆大霉素(400 微克/毫升)和二性霉素(2 微克/毫升的Hanks)液漂洗后,用钝器剥离下粘膜,剪成1mm3 大小.3.消化：在I 型胶原酶和透明质酸酶中,于37℃中消化80 分钟.4.离心：收集细胞悬液,800 转/分离心后,Hanks 液漂洗两次.5.接种：末次离心后加入含有1%～2%胎牛血清的完全培养基,接种入不同孔数的培养板中,接种量依不同实验目的而定.4) 肝细胞培养初代组织块培养：取新鲜肝脏,先剥除被膜和血管等纤维成分,用刀或剪刀把肝脏剪成1mm3 左右的小块,采用帖壁培养法.初代消化法培养：1.把肝组织切成2～4 立方毫米的小块,用不含钙镁的BSS 液洗两次.2.移入1：1 的0.1%胰蛋白酶和0.1%胶原酶(都用无钙镁BSS 配置)中,4℃冷消化10～12 小时后,通过250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过.3.收集细胞、BSS 液洗1～2 次、计数、接种培养.消化培养肝细胞的另一种方法是灌流法(肝脏灌流需用全肝,以较小动物如小鼠和大鼠为好)：1.无菌解剖动物,取出肝脏,先用BSS 洗除血污.2.取5ml 注射器一支,吸取消化液后,把注射器头轻轻插入肝管中,用线绳结扎牢固,以防消化液漏出,轻轻把消化液注入肝管系统,并不时轻揉压肝脏,以便消化液进入肝小叶中;消化液在肝内停留20～30 分后,在吸出消化液的同时并轻揉压肝脏,以使肝细胞脱落和消化液吸出.3.待吸净消化液后,注入离心管中,低速离心分离,用RPMI 1640 培养基培养(较其它培养基为好),能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果.传代培养：待细胞生长连接成片后,用BSS 洗一二次,加1：1 的0.025%胰蛋白酶和0.02% EDTA 混合消化3～5 分钟,待细胞回缩,便停止消化,弃掉消化液,用BSS洗一二次,注入营养液,吹打,制成细胞悬液,再接种培养.5)内皮细胞培养1.取产后的新鲜脐带.如不立即培养可以保存于4℃中,但不宜超过12 小时.无菌剪取长10～15 厘米一段.其它如胚胎和幼体动物的大血管,亦可用于培养.2.先用三通注射器吸温PBS 液注入脐带的静脉中,洗除残血,注入口处宜用线绳结扎,以防液体返流.3.用血管钳夹紧脐带一端,从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1%的胶原酶,待末端出现液体后结扎之,令充满血管,注入口亦应结扎,以防液体返流,消化3～10 分钟.4.吸出含有内皮细胞的消化液,注入离心管中,为获取更多细胞,可再注入温PBS 冲洗2～3 次彻底清除干净残余细胞,一并注入离心管中离心.5.吸除上清,加1640 培养液,制成细胞悬液,接种入瓶皿中培养,顺利时2～3 天内细胞即可长成单层.6)毛细血管内皮细胞培养肿瘤条件培养基制备：1.取C3H 小鼠的S-180 实体肉瘤组织.2.胰蛋白酶消化,Dulbecco 改良Eagle 氏培养液15ml(含10%小牛血清),接种到T-75 Falcon 产培养瓶中培养.3.在细胞生长接近完全汇合时,收集培养液制成条件培养基;再用含10%小牛血清的新培养液后,也每隔两天收集一次,可获得多量条件培养基.4.4000 转/分离心后,再通过0.22μm 微孔滤膜滤过,-20℃冻存备用(临用前融解).初代培养：1.取材：取新鲜牛肾上腺数个,先用Hanks 液洗除血污.2.剥除被膜,分离出皮质,切成1 立方毫米小块,加0.5%胶原酶室温中消化1 小时,每隔10 分钟用吸管吹打悬液令消化充分.3.通过不锈钢纱网滤过,网眼要求只允许能通过小于110 微米长的毛细血管小段.4.650rpm,4℃,离心7 分钟后,弃掉上清胶原酶.5.沉淀物用培养液重悬并离心,再重悬,再离心,共两次.6.末次沉淀物仍用含有10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle 氏培养液重悬后,稍吹打.7.接种于铺有明胶底层的培养皿中,37℃培养,在培养头1～3 小时中,毛细血管小段和内皮细胞最先帖附于底物上,而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮.8.趁此时,吸除培养液,再加入肿瘤条件培养液,每两天换液一次.毛细血管小段一般成自1～4 个内皮细胞,以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛,能持续2～5 天.毛细血管内皮细胞分离培养：1.初代培养2～3 天后,镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛,在培养皿背面,用不脱色笔划圈圈起.2.镜下检查,如圈内残有非内皮细胞时,可用显微细针在倒置显微镜下挑除.此操作用细胞解剖器或用手操作均可,宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行,但时间不宜过长(15～20 分钟),圈内非内皮细胞可用无菌胶刮除.3.用培养液漂洗两次,以去除漂浮细胞.4.剩余内皮细胞岛如小(5～20 个细胞)而少时,生长增值变得缓慢或不完全不生长,此时需加入3T3 等饲细胞,饲细胞接种量为4000 细胞/cm2.5.当内皮细胞充满所有饲细胞空间后,用胰蛋白酶消化、离心、加入肿瘤条件培养基.6.接种入明胶底物皿中继续培养(饲细胞死亡淘汰),细胞增殖生长汇合后,按1：5 传代.

       好了，今天关于“falcon培养皿”的探讨就到这里了。希望大家能够对“falcon培养皿”有更深入的认识，并且从我的回答中得到一些帮助。